流感病毒Z-RNA诱导ZBP1介导的细胞程序性坏死

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摘要：甲型流感病毒(IAV)是一种裂解性RNA病毒，在其感染细胞后，ZBP1通过感应IAV RNA激活受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)介导的凋亡途径和混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)依赖性程序性坏死途经。在该研究中，作者证实了复制中的IAV会生成Z-RNA，从而激活被感染细胞核中的ZBP1。然后，ZBP1在核中启动RIPK3介导的MLKL活化，导致核膜被破坏，DNA渗漏到细胞质中，最终导致坏死。核MLKL诱导的细胞死亡是中性粒细胞的有效活性，中性粒细胞是一种已知的可在IAV疾病中引起炎症病理。因此，MLKL缺陷小鼠肺上皮细胞核破坏量减少，感染肺部的中性粒细胞减少，但致死剂量的IAV后的存活率增加了。这些结果表明Z-RNA是一种新的病原体相关分子模式，并描述了ZBP1启动的核-质膜由内到外的死亡途径，在严重的流感病例中具有潜在的致病性。

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流感病毒Z-RNA诱导ZBP1介导的细胞程序性坏死

Ref：Cell. February 24, 2020, IF=38.637

链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.050

一、研究背景

甲型流感病毒(IAV)是一种正粘病毒科的单股负链RNA病毒，在哺乳动物中IAV病毒株是在呼吸系统中繁殖，并产生从轻微到严重的“流感”病例，有时是致命的疾病。ZBP1也称为DAI或DLM-1是一种核酸传感蛋白，主要是通过感知病毒核酸来介导宿主抵御某些病毒，它包含两个结合Z-DNA和Z-RNA的Zα结构域。这些结构域在体外选择性结合左手双螺旋Z型RNA结构，但是Z-RNA是否在病毒感染期间产生并充当ZBP1的活化配体是未知的。在这项研究中为了解开这一疑惑，作者采用了Discovery Studio 4.5软件模拟生成了dsRNA模型，并在采用DS中Standard Dynamics Cascade程序进行了分子动力学模拟，对产生的构象进行优化。结合生物实验验证了IAV和IBV在复制过程中会产生Z-RNA，并且这些Z-RNA激活被感染核中的ZBP1。激活后，ZBP1会激活RIPK3，后者会磷酸化并激活细胞核中的MLKL。然后，MLKL触发核膜的破坏并促进细胞DNA泄漏到细胞质中，最终导致细胞程序性坏死。刺激成纤维细胞核中的MLKL可以有效招募嗜中性粒细胞，而在MLKL-/-小鼠中发现上皮细胞核损伤减少，嗜中性粒细胞数也减少，由于嗜中性粒细胞是严重IAV疾病的病理驱动因素，所以在注射致命剂量的IAV病毒后，发现突变型小鼠的存活率比野生型小鼠的存活率高，但是病毒复制率没有明显差异。这些发现为Z-RNA作为一种新的PAMP提供了有力的依据，并描述了在严重流感感染中由ZBP1启动的具有致病后果的由内向外的核-质膜死亡信号通路。

二、Z-RNA的产生

作者由前期工作可知ZBP1可能会和IAV的一些短基因组RNA相关，包括DVGs，但Z-RNA是否在病毒感染期间产生，是否是活化ZBP1的配体还需要进一步确定。虽然目前尚无特定检测Z-RNA的抗体，但Z-RNA和Z-DNA共享非常相似的结构，并且针对Z-DNA的抗血清在体外可与Z-RNA发生交叉反应。为了检查抗Z-DNA抗血清是否也可以检测细胞中的Z-RNA，作者首先采用了Discovery Studio 4.5模拟生成了dsRNA模型，并用DS中的分子动力学进行优化，选择具有最低能量的构象进行修饰，结果表明该RNA双链体含有m8Gm的物质可以经历A/Z跃迁，并具有良好的动力学特性。事实上，用CG重复dsRNA中的m8Gm类似物取代大多数鸟苷会产生Z-RNA，并且在体外生理盐浓度下具有显着的稳定性。因此，作者合成了发夹CG重复Z-RNA，其中大多数鸟苷被修饰为m8Gm，同时产生了A-RNA作为对照。并且作者采用电泳迁移率变动分析和免疫荧光实验验证了正粘病毒复制时可产生Z-RNA，并且这些Z-RNA主要位于细胞核中，很可能是DVG起源的，而不是全长基因组，并可能充当ZBP1配体。

三、ZBP1是如何介导细胞程序性坏死

正常情况下，ZBP1主要存在胞质中。但在IAV感染后，ZBP1在细胞核内迅速积累，这表明ZBP1被招募到感染细胞的核中，与IAV Z-RNA共定位并启动RIPK3介导的细胞坏死性凋亡。但是，即使在感染后，ZBP1-Cyto仍然在很大程度上局限于细胞质，这表明ZBP1不需要从细胞核发出信号来激活细胞死亡。另外IAV感染在核内激活RIPK3介导的细胞坏死也会损伤细胞核膜，而核膜破裂和细胞凋亡途径的激活无关，其主要是由核内发生的细胞坏死引起的。细胞核膜受损后，释放核内的DAMPs进入到胞质，这些DAMPs是更有效的中性粒细胞刺激物，增加对中性粒细胞的招募和活化能力，使得IAV感染产生的炎症反应更为强烈，增加IAV疾病的严重性。

四、结论

在本报告中，作者表明IAV和其他正粘病毒可生产Z-RNA，并提出Z-RNA可作为ZBP1的活化配体。结果表明，新形成的IAV RNA双链体可能采用Z-构型，并且作者提出这些Z-RNA结构是由于病毒复制过程中负超螺旋诱导的扭转压力而产生的。由于DVG RNA在病毒复制过程中通常会大量过量生产，并且包装不当而导致衣壳化，使得它们更容易被人感染。所以ZBP1激活配体的主要来源似乎是来自DVG的Z-RNA，而不是全长基因组。ZBP1一旦在细胞核中被激活，就会响应IAV启动由内而外(即细胞核到细胞质)的细胞死亡信号传导。ZBP1活化后不久，大约三分之一的受感染细胞显示出严重的MLKL依赖性核异常。程序性细胞死亡是有效的IAV清除的机制，不仅可以清除被感染的细胞以限制病毒传播，还可以催化适应性免疫反应。但是，当细胞死亡不受限制时，或者当细胞死亡的方式主要是坏死时，那么尽管清除了病毒，仍然会造成伤害和严重疾病。此外，坏死性细胞碎片具有强免疫原性，可以促进中性粒细胞的招募和激活。因为中性粒细胞已显示出在致死性IAV感染过程中触发病原性前馈性炎症反应，并且由于细胞核中含有大量DAMP，包括DNA本身，因此当从破裂的核中释放出来时能够引起炎症的反应。结果表明MLKL介导的核破裂和坏死是IAV致病性的驱动因素，鉴于只要保留RIPK3诱导的凋亡和其他效应功能，坏死对病毒清除是非常重要的。将坏死性病灶阻断(eg，通过RIPK3激酶抑制剂)可作为严重流感病例中的潜在治疗切入点。

图1A-RNA和Z-RNA的结构。

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